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數(shù)字PCR在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用(上)
來源: | 作者:沃小森 | 發(fā)布時間: 2025-01-03 | 257 次瀏覽 | 分享到:

目前,組織活檢是評估腫瘤分子特征的標(biāo)準(zhǔn)生物材料,但仍存在重復(fù)取材困難、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性高等現(xiàn)實問題。液體活檢是對腫瘤在體內(nèi)流出物(主要是血液)中釋放的許多成分的分析,來源于腫瘤的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)已被認為是腫瘤生物標(biāo)志物,可對腫瘤的演變進行動態(tài)監(jiān)測。然而,來源于腫瘤的DNA被體內(nèi)其他細胞釋放的DNA所稀釋,ctDNA僅占總游離DNA的0.01%,檢測ctDNA需要靈敏度較高的技術(shù),而高靈敏度的dPCR技術(shù)在檢測ctDNA上具有很大的優(yōu)勢。

應(yīng)用:ctDNA檢測與腫瘤靶向治療

肺癌是全球死亡率**的惡性腫瘤之一,其中非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌類型的85%。表皮生長因子受體(EGFR)是肺癌的主要驅(qū)動基因。EGFR基因突變主要發(fā)生在18~21號外顯子上,采用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)靶向藥物治療會取得比較好的療效。然而,NSCLC患者在經(jīng)過靶向治療后會發(fā)生繼發(fā)性耐藥,其中50%~60%為EGFR基因T790M突變,而三代EGFR-TKI 藥物AZD9291對這類患者有較好的療效。因此,進行EGFR基因突變檢測對于患者治療方案的選擇以及調(diào)整是非常有必要的。

目前,《NSCLC血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》中推薦可用血漿ctDNA代替腫瘤組織進行EGFR突變檢測。利用具有高靈敏度、**定量優(yōu)勢的dPCR技術(shù)來檢測ctDNA可實現(xiàn)腫瘤的“液體活檢”,可達到NSCLC患者的個體化精準(zhǔn)治療。

文獻案例1:通過dPCR動態(tài)監(jiān)測血液cfDNA中 EGFR T790M水平,有助于晚期NSCLC患者的EGFR-TKI預(yù)后

135例晚期NSCLC患者,同時采用突變擴增系統(tǒng)(ARMS)和dPCR方法對這些患者EGFR-TKI治療前后血漿中的循環(huán)游離DNA(cfDNA)進行T790M突變檢測。

結(jié)果表明,T790M在不同DNA稀釋中的陽性信號比(紅/藍信號)為:1∶100 (115/659)、1∶300 (20/686)、1∶1000 (15/692)、1∶3000 (5/702) (圖 1) 和 1∶10000 (0/686)。因此,dPCR檢測T790M突變的檢出限約為 0.03‰ ,其檢出率高于ARMS,更加適用于T790M突變的檢測。

圖 1:紅色+藍色信號的腔室代表T790M 陽性信號;腔室中只有藍色信號表示T790M陰性。


通過ARMS和dPCR分別在TKI前和TKI后血漿中檢測到T790M 突變(表 2)。在TKI前血漿樣本中,ARMS僅在5.5%的患者中檢測到T790M (6/103),而dPCR在31.1% 的患者中檢測到T790M(32/103)。在135例TKI后血漿樣本中,dPCR鑒定出T790M陽性樣本的頻率高于ARMS(43.0% vs. 25.2%)。

TKI治療前后血漿cfDNA中T790M突變的頻率分別為31%和43%,與在腫瘤組織樣本中觀察到的頻率相似。作為一種高靈敏度和定量的方法,dPCR已被用于評估EGFR突變,血漿cfDNA中的T790M定性和定量可以預(yù)測 EGFR-TKI的存活率。此外,動態(tài)監(jiān)測 T790M 變化可能有助于確定 EGFR-TKI 預(yù)后。

文獻案例2:通過尿液ctDNA檢測動態(tài)追蹤EGFR-TKI治療NSCLC患者的EGFR突變

選取150例EGFR突變并接受EGFR-TKI的患者參與研究。利用 ddPCR技術(shù)量化了尿液、血液中的EGFR突變,并與原發(fā)性癌癥組織樣本做對比。

結(jié)果表明,尿液ctDNA在檢測EGRF突變方面與組織相比有88%的一致性,且檢測靈敏度與血漿結(jié)果相當(dāng)(如圖2)。

圖2:A:原代組織和尿液ctDNA之間的EGFR突變比較。B:不同樣本之間EGFR一致性狀態(tài)比較。

對不同時間點尿液細胞游離 DNA 的分析顯示與治療效果有很強的相關(guān)性。在監(jiān)測過程中,53%的患者檢測到繼發(fā)性EGFR T790M突變,結(jié)果與血漿ctDNA分析相印證。T790M陽性突變與野生型組相比,中位生存期降低(圖3)。

圖3:a:研究隊列中的 T790M 突變頻率。b :尿液ctDNA的個體趨勢。箭頭表示在常規(guī)尿液分析中檢測到 T790M 的時間段。c:使用尿液ctDNA檢測不同T790M狀態(tài)患者的總生存期。

尿液樣本是無創(chuàng)且容易獲得的,尿液ctDNA可能是組織樣本EGFR突變檢測的潛在替代物,利用ddPCR技術(shù)來檢測尿液ctDNA的EGFR突變可以作為無創(chuàng)監(jiān)測TKI治療的有效手段。

參考文獻:

[1] Wang Z, Chen R, Wang S, Zhong J, Wu M, Zhao J, Duan J, Zhuo M, An T, Wang Y, Bai H, Wang J. Quantification and dynamic monitoring of EGFR T790M in plasma cell-free DNA by digital PCR for prognosis of EGFR-TKI treatment in advanced NSCLC. PLoS One. 2014 Nov 18;9(11):e110780. doi: 10.1371/journal.pone.0110780. PMID: 25405807; PMCID: PMC4236040.

[2] Chen S, Zhao J, Cui L, Liu Y. Urinary circulating DNA detection for dynamic tracking of EGFR mutations for NSCLC patients treated with EGFR-TKIs. Clin Transl Oncol. 2017 Mar;19(3):332-340. doi: 10.1007/s12094-016-1534-9. Epub 2016 Jul 28. PMID: 27468867.


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